Quyết định 5432/2001/QĐ-BYT Thường quy kỹ thuật định tính bán định lượng độc tố vi nấm Aflatoxin trong thực phẩm

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH “THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ theo Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hoá;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ- TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ Pháp chế, Chánh thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm,

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm Aflatoxin” trong thực phẩm.

Điều 2. Quyết định này có hiệu lực sau 15 ngày kể từ ngày ký ban hành.

Điều 3. Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế Dự phòng – Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

(Ban hành kèm theo Quyết định số: 5432/QĐ – BYT ngày 19 tháng 12 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

1. Nguyên tắc

Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và được làm sạch qua cột silicagel. Làm bay hơi dung  dịch rửa giải, hoà tan cặn thu được với clorofoc hoặc hỗn hợp toluen axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử  lên bản mỏng, chạy sắc ký, so sánh màu, hệ số R_f  và cường độ phát quang của mẫu chuẩn và mẫu thử, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo cường độ huỳnh quang.

2. Phạm vi áp dụng

Xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu.

3. Dụng cụ, hoá chất, thuốc thử

3.1. Dụng cụ, thiết bị

3.1.1. Máy xay nghiền mẫu

3.1.2. Máy lắc hoặc máy khuấy từ

3.1.3. Cân phân tích.

3.1.4. Máy cất quay chân không.

3.1.5. Bếp cách thuỷ.

3.1.6. Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm.

3.1.7. Quang phổ kế UV-VIS.

3.1.8. Máy đo cường độ huỳnh quang.

3.1.9. Bình sắc ký: rộng 5cm, cao 25 cm, dài 25cm.

3.1.10. Cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khoá nút mài thuỷ tinh hoặc teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250ml.

3.1.11. Bình nón nút mài 250ml, 500ml.

3.1.12. ống đong 50ml, 100ml.

3.1.13. Phễu lọc chân không, đường kính 8 - 10 cm.

3.1.14. Micropipet: 20ml, 50ml

3.1.15. Bình cầu cất 250 ml.

3.1.16. Bản mỏng kích thước 20 x 20 cm tráng sẵn lớp mỏng Silicagel 60-G

3.1.17. Bình phun sương.

3.2. Hoá chất, thuốc thử

Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác.

3.2.1. Axeton

3.2.2. Clorofoc

3.2.3. n - hexan

3.2.4. Ete etylic khan

3.2.5. Metanol

3.2.6. Axetonitril

3.2.7. Toluen

3.2.8. Natri sunfat khan

3.2.9. Celite 545, đất điatomit

3.2.10. Axit sunfuric 50% (v/v)

3.2.11. Axit trifloaxetic dung dịch iot 10%

3.2.12. Khí nitơ

3.2.13. Bông hút nước (được loại béo bằng clorofoc) hoặc bông thuỷ tinh.

3.2.14. Các hệ dung môi khai triển sắc ký.

- Clorofoc/ axeton: 9/1 (v/v) (theo tỷ lệ thể tích)

- Ete etylic / metanol/ nước: 94/4.5/1.5/ (v/v/v)

- Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nước: 88/12/1.5/1 (v/v/v/v)

- Toluen/ etyl axetat / axit formic: 6/3/1 (v/v/v)

3.2.15. Hệ dung môi rửa giải:

- Metanol/clorofoc: 3/97

3.2.16. Silicagel dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 ¸ 0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105^oC trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín.

3.2.17. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng):

3.2.17.1. Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A):

Lấy ống chuẩn 1 mg của mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen - axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10mg/ml).

3.2.17.2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV – VIS, bước sóng 350 nm, so với mẫu trắng (toluen + axetonitril) tính kết quả theo công thức:

Trong đó:          

m - Khối lượng phân tử aflatoxin

A – Cường độ quang ở bước sóng hấp thụ

e - Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin

3.2.17.3. Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B):

Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2; 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen  axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 mg/ml đối với B1, G1 và 0,1 mg/ ml đối với B2, G2.

Bảo quản:

Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0⁰C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần.

4. Phương pháp tiến hành

(Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng )

4.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu sau khi nghiền được rây quan rây, lỗ rây cỡ 1 mm.

Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, như lạc, hạt có dầu…. cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ete dầu hoả (độ sôi 40 – 60⁰ C) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu.

4.2. Tiến hành xét nghiệm

4.2.1. Chiết suất:

Cân 50g mẫu đã nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu lọc không chân có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không.

4.2.2. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký:

Chuẩn bị cột sắc ký:

Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (3.2.15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên.

Trộn 50ml dịch lọc trên (4.2.1) với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ete etylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút.

Rửa giải aflatoxin bằng 150ml hỗn hợp metanol - clorofoc (3: 97).  Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 50_­^oC cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 50⁰C, tốt nhất dưới luồng khí nitơ nhẹ, cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng.

4.2.3. Thử nghiệm định tính bằng sắc ký lớp mỏng một chiều

Chuẩn bị:

Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp toluen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký.

Với bản mỏng  tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau:

1. Lấy 2; 5;10; 20 ml dung dịch chuẩn B (3.2.17.3).

2. Lấy 10 ml dịch chiết với 10 ml dung dịch chuẩn B (3.2.17.3).

3. Lấy 10, 20 ml dịch chiết.

- Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau.

Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh  quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn.

R_f của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofoc - axeton (9-1) có trị số trung bình như sau:

Aflatoxin B₁: 0,72

Aflatoxin B₂: 0,67

Aflatoxin G₁: 0,59

Aflatoxin G₂: 0,54

4.2.4. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin:

- Rót dung dịch iôt 10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ete bay hơi hết còn lại một lớp iôt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin.

- Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thử và dung dịch aflatoxin chuẩn như sau:

Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như  sau:

1. 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

2. 10 ml dịch chiết

3. 10 ml dịch chiết với 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

4. 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

Phần 2: Bên phải, chấm 4 vết như sau:  

5. 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

6. 10 ml dịch chiết

7. 10 ml dịch chiết với 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

8. 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.2.17.3)

Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axit trifloaxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển.

Dung môi khai triển: Nước/metanol/ete etylic – 1/3/96 (v/v).

Khi tiền tuyến dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm.

Đánh giá kết quả:

- Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số R_f nhỏ hơn R_f của vết tương ứng ở nửa bên phải, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh .

- Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn  và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số R_f bình thường, và màu huỳnh quang xanh  chuyển sang màu vàng.

4.2.5. Bán định lượng:

4.2.5.1. Bằng mắt:

Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.

Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 ml dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu cường độ huỳnh quang của vết 10 ml dịch chiết đậm hơn cường độ huỳnh quang của vết 20 ml dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại.

4.2.5.2. Bằng máy đo cường độ huỳnh quang:

Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.

Tính kết quả:

Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau:

Trong đó:

A_m- Cường độ huỳnh quang của vết mẫu.

A_s - Cường độ huỳnh quang của vết chuẩn.

X - Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng (ml ).

Y - Thể tích của dịch chuẩn  chấm lên bản mỏng (ml ).

S - Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn (mg/ml).

V- Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có (ml).

W- Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột ( g).

4.3. Độ nhậy  của phương pháp:  5 mg / kg (5 ppb)

- Hệ số thu hồi của phương pháp: 90 ± 5%.

- Sai số trung bình của phương pháp: ± 10%.